¢ 产品规格
产品名称 | 规格 | 产品编号 | 组分名称 | 组分规格 | 目录价 |
线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123) | 100-1000T | RBK001-A | Rhodamine 123 (1000X) | 100 µL | ￥680 |
RBK001-B | 染色缓冲液 | 100 mL |
RBK001-C | CCCP (10mM) | 20 μL |
¢ 产品简介
线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123) (Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with Rhodamine 123)是一种以Rhodamine 123为荧光探针对线粒体膜电位进行检测的试剂盒。本试剂盒可用于活细胞线粒体膜电位的检测，也可使用荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测设备进行检测。
Rhodamine 123也称2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester，中文名为罗丹明123，分子式为C21H17ClN2O3，分子量为380.82，CAS号为62669-70-9。Rhodamine 123是一种通透细胞膜的黄绿色阳离子荧光探针，最大激发光波长为507nm，最大发射光波长为529nm。
本试剂盒检测线粒体膜电位的原理如下。在正常细胞中，Rhodamine 123能够依赖线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential, ΔΨm)选择性进入线粒体基质，可发出明亮的黄绿色荧光；当细胞发生凋亡或坏死时，线粒体膜电位丢失，线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)持续开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm)的崩溃，Rhodamine 123从线粒体中释放出来，从而导致线粒体内黄绿色荧光强度的明显降低。Rhodamine 123可以快速通过细胞膜，仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所捕获(sequestered by active mitochondria)，并且对细胞没有明显毒性，适用于大多数哺乳动物细胞及酵母。
本试剂盒提供的Rhodamine 123为 1000X 溶液，，对大多数细胞都适用。但为了得到满意的结果，对于不同类型的细胞请自行进行摸索。Rhodamine 123的终浓度一般为0.1X-5X，最优先的推荐终浓度为1X，染色时间通常为20~60分钟。试剂盒提供的CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照，终浓度一般为1-20μM，最优先的推荐终浓度为10μM。
¢ 保存条件
-20℃保存，一年有效。其中Rhodamine 123 (1000X)需要-20℃避光保存。
¢ 使用方法
1. 试剂准备
1.1 Rhodamine 123染色工作液配制
1) 按每1µl Rhodamine 123 (1000X)加入1ml检测缓冲液的比例稀释Rhodamine 123，混匀后即为Rhodamine 123染色工作液。6孔板每孔所需Rhodamine 123染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的Rhodamine 123染色工作液的用量按需配置。
注：1.配制Rhodamine 123染色工作液时注意避光，且须现配现用，不能长期保存。
2.检测缓冲液也可用细胞培养液代替，但培养液中不能含有血清，否则会影响Rhodamine 123的染色效果。
3.染色工作液中Rhodamine 123的最终浓度推荐为1×，实际浓度需根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。
1.2 阳性对照组设置
1) 取试剂盒提供的 CCCP (10mM)，按1:1000比例加入细胞培养液中，稀释至终浓度 10μM。
2) 37℃孵育细胞 20 分钟后，与待测样本同步进行Rhodamine 123染色。
注：对于大多数细胞，10μM CCCP 处理 20 分钟可使线粒体膜电位完全丧失，染色后呈单一绿色荧光；特定细胞系的最佳作用浓度与时间需参考文献优化。
2. 悬浮细胞样本处理
1） 取适量细胞600×g室温离心5min，弃上清，加入适当体积的 Rhodamine 123 染色工作液重悬细胞，细胞数量约为 10-100 万/mL。
2）置于 37℃、5% CO₂细胞培养箱中避光孵育 20 分钟。
3） 孵育结束后，600×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意避免吸走细胞沉淀）。
4） 用37℃预热的染色缓冲液洗涤细胞 2 次：加入 1 mL 缓冲液重悬细胞，600g 4℃离心 5 分钟，弃上清，重复此操作 2 次。
5） 用适量细胞培养液重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光酶标仪或流式细胞仪分析。
3. 贴壁细胞样本处理
3.1 荧光显微镜 / 激光共聚焦显微镜直接观察
1) 吸除 6 孔板中细胞培养液，必要时用 PBS 轻柔洗涤 1 次，加入 1mL 完全细胞培养液。
2) 加入 1mL Rhodamine 123 染色工作液，轻轻晃动培养板使液体均匀覆盖细胞。置于 37℃、5% CO₂细胞培养箱中避光孵育 20 分钟。
3) 吸除上清，用染色缓冲液轻柔洗涤细胞 2 次。
4) 加入 2mL 37℃预热的完全细胞培养液（培养液中可以含有血清和酚红），立即置于显微镜下观察。
4. 纯化线粒体样本处理
1) 取 0.9mL Rhodamine 123 染色工作液，加入 0.1mL 总蛋白量为 10~100μg 的纯化线粒体悬液，轻柔混匀。
2） 荧光分光光度计检测：设置激发波长 507nm、发射波长 529nm，进行时间扫描；若使用荧光酶标仪，激发波长可在 490~590nm 范围内调整。
3）荧光显微镜 / 激光共聚焦显微镜观察：参考下文仪器参数设置进行检测。
5. 结果判读与仪器参数
5.1 标准仪器参数设置
检测靶标 | 激发波长 (Ex) | 发射波长 (Em) | 显微镜参考通道 |
Rhodamine 123（黄绿色荧光） | 507 nm | 529 nm | FITC 通道 |
5.2 结果判读标准
1) 正常细胞：线粒体膜电位正常，Rhodamine 123在线粒体内聚集发出明亮的黄绿色荧光
2） 处理组细胞：使用CCCP诱导使线粒体膜电位下降后，线粒体内黄绿色荧光强度明显下降，几乎完全消失。
¢ 注意事项
1) 所有染色操作需在避光条件下进行，避免荧光淬灭。
2) 染色完成后需在30 分钟内完成检测，检测前样本需置于冰浴中保存。
3) Rhodamine 123 染色缓冲液需在无菌环境中使用，微生物污染会严重影响染色效果。
4) CCCP 具有毒性，操作时需穿戴实验服、一次性手套，避免直接接触皮肤、黏膜或吸入。
5) 反复冻融会导致 CCCP 活性显著下降，建议首次使用时分装为 10~20 μL / 管的小份；若短期内 (2 周内) 频繁使用，可暂存于 2~8℃避光环境。
6) 本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内！